اسپکتروفوتومتر (طیف‌ سنجی نوری)

اسپکتروفوتومتر (طیف‌ سنجی نوری)

مفاهیم پایه

اسپکتروفوتومتر (spectrophotometer) متشکل از دو وسیله، یعنی  Spectr (طیف سنج) برای تولید نور از هـر رنـگ انتخـاب شـده (طـول مـوج)  و  photometer (نور سنج) برای اندازه گیری شدت نور است.

اسپکتروفتومتری یا طیف سنجی روشی است که با استفاده از عبور نور از یک آنالیت در یک محلول شیمیایی و تعیین میزان جذب و عبور نور از آن به تعیین خصوصیات آن آنالیت و ماده شیمیایی می پردازد. نور مورد استفاده طیفی از انرژی الکترومغناطیس می¬باشد که هر طیف نوری دارای طول موج و فرکانس مشخصی است.

دستگاه اسپکتروفتومتر :

دستگاه اسپکتروفتومتر یکی از دستگاه های مورد استفاده در روش طیف سنجی یا اسپکتروفتومتری می باشد.

یک دستگاه اسپکتروفتومتر از منبع نور – تک¬ فام ساز (مونوکروماتور) – شکاف عبور یا متمرکز کننده پرتو – کووت یا سل (محل قرار دادن نمونه) – دتکتور یا آشکارساز و صفحه نمایشگر تشکیل شده است.

 

فیزیولوژی

قند خون، انواع چربی ها، اسید اوریک، اوره و غیره از جمله موادی هستند که باعث بروز بیماری‌های مختلف برای افراد می شوند. اندازه‌گیری غلظت این مواد توسط اسپکتروفوتومتر امکان پذیر است.

 

چگونه کار می کند؟

اسپکتروفتومتر نور ثابت با طول موج دلخواه به وجـود مـی آورد. پـس از عـبـور نـور از مـحـلـول، نـور بـاقیمـانـده به قسمت نورسنجی یا فوتومتر می رود. فوتومتر  از نوع فتومولتی پلایر تیوب، فوتو دیود و… نـور را بـه سیگنـال الکتـریکـی تبـدیـل می کند. سپس سیگنال های دریافت شده اندازه گیری و پردازش می شـونـد تـا کمیـت مـورد نظـر بـه دسـت آیـد. خـروجی اسـپـکـتــروفــوتــومتـر همیشـه نمـوداری از شـدت نـور نسبت به طول موج است. داده‌هایی که برای تولید نـمـودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طـول مـوج ذخیره می‌شود. مقدار گراف بیان کننده مـقـدار عبور یا مقدار جذب اسـت. اسپکتـروفـوتـومتـرهـای امـروزی دیجیتـالی بوده و به وسیله میکروپروسسور کنترل می شوند.

میزان جذب هر ماده شیمیایی در طول موج های مختلف انرژی الکترومغناطیس متفاوت می باشد. با توجه به این امر، هر ماده شیمیایی در طول موج خاصی از انرژی الکترومغناطیس حداکثر جذب و حداقل عبور را خواهد داشت که این فرآیند در جهت تعیین خاصیت آن ماده شیمیایی استفاده می شود.

همچنین غلظت هر ماده شیمیایی نیز در میزان جذب طول موج خاصی از امواج الکترومغناطیس تاثیر دارد. بطوریکه با افزایش غلظت ماده، میزان جذب در طول موج مشخص افزایش و با کاهش غلظت، میزان جذب کاهش و مقدار نور عبوری افزایش می یابد که به نام قانون بیر شناخته می شود.

در این روش با استفاده از تاثیر متقابل غلظت ماده و میزان جذب نور عبوری از آن ماده، به تعیین رابطه و معادله غلظت – جذب هر ماده شیمیایی می پردازند که کاربردهای زیادی در شیمی و تجزیه و تحلیل مواد شیمیایی دارد.

قانون بیر :

با افزایش غلظت ماده، میزان جذب در طول موج مشخص افزایش و با کاهش غلظت، میزان جذب کاهش و مقدار نور عبوری افزایش می یابد که به نام قانون بیر شناخته می شود.

 

در چه مواردی به کار می رود؟

از این دستگاه برای اندازه گیری غلظت ماده رنگی محلول ها، به طور مثال اندازه گیری قند، اسید اوریک، کلسترول، آنزیم های مختلف و… استفاده می شود. این دستگاه قابلیت اندازه گیری نمونه های فوق العاده کوچک را داشته لذا از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکول‌هایRNA،استفاده می‌شود.

 

نحوه عملکرد دستگاه اسپکتروفتومتر :

اسپکتروفتومترها دارای دو نوع منبع نور جهت تولید نور می باشند که از لامپ تنگستن یا هالوژن برای تولید نور مرئی Vis و مادون قرمز با طول موج ۳۲۰ تا ۱۱۰۰ نانومتر و از لامپ دوترییوم برای تولید امواج ماوراء بنفش UV با طول موج ۱۹۰ تا ۳۲۰ نانومتر استفاده می کنند.

نور تولید شده در ادامه مسیر با استفاده از مونوکروماتور یا تک رنگ ساز فیلتر شده و در طول مسیر با استفاده از چند منشور و توری پراش، طول موج خاصی انتخاب می شود. نور با طول موج خاص انتخاب شده از شکاف عبور یا متمرکز کننده پرتو عبور می کند.

سپس نور مذکور در داخل سل هولدر به کووت رسیده و از نمونه عبور می کند.

قسمتی از نور مذکور در داخل نمونه جذب و مابقی عبور می کند. نور عبوری به دتکتور یا آشکارساز رسیده و پس از تعیین شدت نور و تبدیل آن به انرژی الکتریکی توسط صفحه نمایشگر نشان داده می شود.

 

اجزاء اسپکتروفوتومتر

اسپکتروفوتومتر از چهار قسمت تشکیل شده است:

– منبع نور و منوکروموتور : جهت ایجاد در یک باند طیفی وسیع

– نمونه

– آشکارساز: در قسمت خروجی پس از عبور نور تک رنگ از ماده، سیستم دارای یک آشکارساز نـوری جـهـت اندازه گیری شدت نور دریافت شده است.

–  پردازش کننده و نمایش دهنده: جهت محاسبه مقدار جذب و یا عبور نور و نمایش آن بر روی صفحه نمایشگر است.

از مقایسه میزان شدت نور ورودی به نمونه مورد نظر در یک طول موج خاص با شدت نور خارج شده از آن نمونه، غلظت نمونه مورد نظر محاسبه می شود.

در سیستم های جدید اسپکتروفوتومتری یک برد مـیـکـروپروسسوری به همراه یک نرم افزار طراحی شـده وظیفـه کنتـرل و ایجـاد ارتبـاط بیـن بخـش های مختلف سیستم، پردازش سیگنال و محاسبات و به طور کلی خودکار کردن برخی فعالیت های سیستم را بر عهده دارد.

 

انواع مختلف دستگاه اسپکتروفوتومتر

اسپکتروفوتومتری مرئی و ماوراء بنفش (UV/Vis)  و اسپکتـروفـوتـومتـری فـرابنفـش-مـرئی-مادون قرمز نزدیک (Uv/Vis/NIR) دو نوع عمده این دستگاه هستند.

دستگاه های اسپکتروفتومتر ماوراء بنفش / مرئی به عنوان پر مصرف ترین دستگاه های اسپکتروفتومتر در آزمایشگاه بوده که در آن با توجه به میزان عبور و جذب ، غلظت مواد در یک نمونه تعیین می شود .

عموما منابع نوری قابل استفاده در این دستگاه یک لامپ هالوژن تنگستن، برای نور مرئی و یک لامپ دوتریم برای نور  UVاست. این دستگاه دارای مدل مـخـتـلـفــی اســت.  بــرای مـثــال سیستـم جهـت انـدازه گیری‌های کمی با کارایی بالا در بازه۹۰۰-۱۹۰ نانو متر طـراحـی شده است. کاربرد های نوعی این دستگاه عـبــارتـنــد از: آنــالـیــز رنـگــی رنـگ هـا و مـنـسـوجـات، محلول‌های کدر، مطالعات سینتیکی آنزیمی در علوم زیستی، بیو‌شیمی و آزمایشگاه های دارویی.

اسپکتـرومتـر مـرئـی/مـاورای بنفـش قـابلیـت اندازه گیری های با کارآیی بالا را تا طول موج ۳۳۰۰ نانو متر و با دقت بالا را ارائه می کند. از جمله کاربرد های این دستگاه می توان به مطالعه پوشش های انعکاسی و ضد انعکاسی، پوشش های اصلاح رنگ، تشخیص پهنای نوار عبوری فیلتر های فرابنفش، مرئی و مادون قرمز نزدیک اشاره کرد..

در هنگام استفاده از اسپکتروتومتر نکات ذیل را باید رعایت کنیم:

• دستگاه اسپکتروفتومتر باید روی یک سکو با سطح صاف و بدون شیب و بالاتر از سطح زمین قرار گیرد.
• دستگاه اسپکتروفتومتر نباید در نزدیکی دستگاه هایی که امواج الکترومغناطیس و امواج الکتریکی شدید تولید می کنند، قرار گیرد.
• در هنگام راه اندازی دستگاه اسپکتروفتومتر و وصل آن به برق، باید از UPS یا ثابت کننده جریان و محافظ برق استفاده نمود.
• بعد از روشن شدن دستگاه، حداقل زمان لازم برای پایداری دستگاه ۱۵ دقیقه می باشد. پس از این مدت دستگاه گرم شده و به پایداری حرارتی و الکترونیکی می رسد و برای استفاده آماده می باشد.
• از ریختن نمونه در داخل سل هولدر و روی دستگاه خودداری نمایید. همچنین پس از استفاده از دستگاه، باید دستگاه و سل های مربوطه را تمیز و روی دستگاه کاور کشید.